4.4.1 SECUENCIACION DEL ADN
La secuenciación de genes constituye una tarea esencial para el
desarrollo de muchos proyectos de investigación en el campo biológico,
biomédico e industrial que hagan uso de las metodologías del ADN
recombinante o de la Ingeniería Genética. La Genómica es un área de la
Biología cuyo objetivo es el estudio de los genomas, el conjunto de
genes que especifican todos los caracteres que pueden ser expresados en
un organismo. El término Proteómica trata de describir la ciencia o
tecnologías que estudian el proteoma, el conjunto de proteínas que se
expresan a partir de un genoma.
BIBLIOGRAFIA
http://pcs.usal.es/index.php?option=com_content&task=view&id=378&Itemid=286
La secuenciación de ADN o ácido desoxirribonucleico es una técnica de
análisis molecular que permite la determinación del orden de los
nucleótidos o unidades que componen esta molécula, que contiene la
información genética de los seres vivos. Cada nucleótido está formado
por una molécula de desoxirribosa fosforilada y una base nitrogenada.
Existen 4 bases nitrogenadas (Adenina: A, Citosina: C, Guanina: G y
Timina: T) en el ADN de todos los organismos de la naturaleza. La
lectura encadenada de los nucleótidos da como resultado una secuencia de
ADN. En la naturaleza se producen cambios o mutaciones en el ADN que
tienen efectos significativos sobre el funcionamiento de los organismos,
por lo que su identificación mediante la técnica de secuenciación es
fundamental para estudios genéticos tanto en investigación como en
diagnóstico clínico.
BIBLIOGRAFIA
http://www.investigacionpuertadehierro.com/index.php/investigacion/core-facilities/secuenciacion-de-adn/tecnica/
La introducción de métodos rápidos de
secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los
estudios sobre el DNA Existen TRES métodos de secuenciación de los ácidos
nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de
cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de
terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). Y actualmente el
metodod automatizado con lectores laser de capilaridad. El fin de ambos es
conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un
fragmento de ácido nucleico.
En
el método químico
un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por
acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la
acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos
fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas
específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y
trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las
cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento
posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base
había sido alterada.
Un cebador o "primer" que suele
ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario
para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3'
OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del
fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de
nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un
"primer" con secuencia complementaria al vector empleado para
clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del
vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia
se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucleótidos
trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente
el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato
en cada reacción.
Los fragmentos de ADN de nueva
síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por tamaños mediante
electroforesis en geles verticales de acrilamida que permiten distinguir
fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.Los productos de
cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro carriles
diferentes del gel.
Una vez terminada la
electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de
autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la
autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la
secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base
correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.
La principal
diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método
automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En
el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo
habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido
trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite
automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs
de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.
La segunda
diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La
detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a
cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN
de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel,
permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden
determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.
BIBLIOGRAFIA
http://medicina-genomica.blogspot.mx/2011/04/que-es-la-secuenciacion-de-adn.html
http://genemol.org/biomolespa/secuencia/secuencia.html
