Corte específico del
ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la
utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de
restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares".
Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres,
siendo lo característico de ellas estos dos principios:
- Cada enzima de restricción reconoce una secuencia
específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de
las cadenas de ADN.
- Los extremos libres que quedan se llaman extremos
pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que
hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.
En este esquema se indica el lugar en el que
corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas
hebras.
En este esquema se ve el resultado de la
actuación de la enzima de restricción.
Ha quedado rota la molécula de
ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede
unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie
diferente.
PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA
RECOMBINANTE
Enzimas
de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas
por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente
específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los
ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares
específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que
ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos
infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de
grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.
Algunas de las
principales enzimas de restricción conocidas y su origen
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Enzima de
restricción
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Organismo de
donde se extrae
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EcoRI
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Escherichia coli
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EcoRII
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Escherichia coli
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HindII
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Haemophilus influenzae
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HindII
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Haemophilus
influenzae
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HaeIII
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Haemophilus
aegyptius
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HpaII
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Haemophilus
parainfluenzae
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PstI
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Providencia stuartii
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Mayi
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Serratia marcesens
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BamI
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Bacillus
amyloliquefaciens
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BglII
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Bacillus globiggi
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Las enzimas de
restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases
nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de
restricción y producen dos tipos de corte:
Otro método para producir fragmentos
pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos
son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser
un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos
aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin
embargo son empleados por su facilidad de uso.
Algunas
enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio
de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia
palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una
simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio
de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se
produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En
este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA,
leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto
comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.
Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores
de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en
las células hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad
para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y
virus. de introducirlos en las células hospedadoras.
Plásmidos.
Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del
cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen
su propio origen de replicación.
Plásmidos, pequeños fragmentos circulares
de ADN, están presentes prácticamente en todas las células bacterianas.
Contienen de 2 a 30 genes. Algunos tienen la capacidad para incorporarse o
salir del cromosoma bacteriano.
Los plásmidos son moléculas
circulares de ADN que se replican de manera independiente al cromosoma de la
célula hospedera. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaños
que van desde 5,000 hasta 400,000 pb.
* VECTORES
Y HOSPEDADORES
Los vectores son
unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y
los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe
contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la
maquinaria celular hospedadora.
Los vectores son
propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S.
cerevisiae) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas
como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura
(YAC) (5) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC) (6).
los vectores
tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN.
Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia
genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina,
cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene
una longitud de secuencia de 2.4 Mb (7).
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TIPOS de VECTORES
y HOSPEDADORES
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VECTOR
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HOSPEDADOR
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ESTRUCTURA
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CAPACIDAD kb
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Plásmidos
Bacteriófagos
Cósmidos
BACs
YACs
MACs
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E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
Levadura
Células mamíferas
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Plásmidos
Circulares
Plásmidos Circulares
Plásmidos Circulares
Plásmidos Circulares
Cromosomas lineales
Cromosomas lineales
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5-10
5-10
35-45
hasta 300
100-2000
>1000
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* Métodos de introducción del vector.
El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen
que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse,
origine un clon celular que lleve el gen concreto.
Existen varios
métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
-Transformación. Ocurre
espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente
sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las
introduce en su interior y las incorpora a su genoma.
-Transducción. Este método consiste en
introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como
vector de clonación el genoma del virus.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1
corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva
un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2,
corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de
contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus
inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.
* Selección
de celulas recombinanates
Además del origen de replicación,
los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores,
que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación.
Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos
y genes de bioluminiscencia.
Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de
clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen
marcador.
Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar,
tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora
determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la
célula hospedadora es una célula eucariota.
BIBLIOGRAFIA
