UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
10.1
Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos.
La
extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas.
En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana
plasmática para poder acceder al núcleo de la célula.
A continuación debe romperse también la membrana nuclear
para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN
de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que
precipite en alcohol.
La
solución de lavavajillas y sal ayudada por la acción
de la licuadora es capaz de romper la pared celular y las membranas
plasmática y nuclear.
Los
zumos de piña y papaya contienen un enzima, la papaína,
que contribuye a eliminar las proteínas que puedan contaminar
el ADN.
El
alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua
pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en
la interfase entre el alcohol y el agua.
ADN en la interfase
agua-alcohol
Centrándose
en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis: lisis
diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN
obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de
amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente
por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan,
preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro
separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora
presentes en la solución de ADN. El ADN una vez limpio de proteínas y/o
pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de
las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o
precipitación con alcohol.
Una vez
conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el
propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
En
ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor
diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:
1. separación y visualización de dicho
fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de
infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos
el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento
en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad
de un exon mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exon normal...)
2. detección del fragmento amplificado mediante
ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.
Por el
contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el
fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes
técnicas:
1. Corte con enzimas de restricción. Los
fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o
poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...).
2. Hibridación. Los fragmentos generados en el PCR se separan
en gel de agarosa, se transfieren a un
soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN
sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...).
3. Secuenciación. Los fragmentos generados durante la reacción
de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej.
Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas
enfermedades...).
BIBLIOGRAFIA
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