10.5 Tecnología del ADN Recombinante

La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la expresión génica, en la regulación de la producción comercial de síntesis de proteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos y en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen determinado. En este último caso, existe una técnica mejor, denominada con las siglas PCR.

La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a su vez, dentro de una célula, denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína codificada en el gen. Además, al dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también sintetizan esa proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto.

Las etapas en la producción de ADN recombinante son las siguientes:

1. Preparación de la secuencia del ADN para su clonación
   
   
2. Preparación de un vector de clonación
   
   
3. Formación del ADN recombinante
   
   
4. Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona
   
   
5. Propagación del cultivo
   
   
6. Detección y selección de clones recombinantes
   
   

 

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:
   • Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
   • Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción. 
   
    
   
    En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.
   
    
    En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.
   Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.
   
   
   PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE
   
   
   Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
   
   Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.
   
   
   Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen
   
   

   Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
   EcoRI	Escherichia coli
   EcoRII	Escherichia coli
   HindII	Haemophilus influenzae
   HindII	Haemophilus influenzae
   HaeIII	Haemophilus aegyptius
   HpaII	Haemophilus parainfluenzae
   PstI	Providencia stuartii
   Mayi	Serratia marcesens
   BamI	Bacillus amyloliquefaciens
   BglII	Bacillus globiggi

   
   
   
   
    
   Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:
   
   
    
   Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.
   
   Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.
   
   
   
    
     Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.
   Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
   Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.
    
   
   
   
    
   Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.
    
   Plásmidos, pequeños fragmentos circulares de ADN, están presentes prácticamente en todas las células bacterianas. Contienen de 2 a 30 genes. Algunos tienen la capacidad para incorporarse o salir del cromosoma bacteriano. 
   
   
    Los plásmidos son moléculas circulares de ADN que se replican de manera independiente al cromosoma de la célula hospedera. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaños que van desde 5,000 hasta 400,000 pb.
    
   
   
    

   *  VECTORES Y HOSPEDADORES

    

   Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora.
   
   
   Los vectores son propagados en hospedadores que pueden ser células de E. coli, levadura (S. cerevisiae) o células mamíferas. Los vectores pueden ser estructuras sencillas como plásmidos o muy complejos como los cromosomas artificiales de levadura (YAC) (5) y los cromosomas artificiales mamíferos (MAC) (6).
   
   
   los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb (7).
   
   

   TIPOS de VECTORES y HOSPEDADORES
   VECTOR	HOSPEDADOR	ESTRUCTURA	CAPACIDAD kb
   Plásmidos Bacteriófagos Cósmidos BACs YACs MACs	E.coli E.coli E.coli E.coli Levadura Células mamíferas	Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Cromosomas lineales Cromosomas lineales	5-10 5-10 35-45 hasta 300 100-2000 >1000

    
    
   *  Métodos de introducción del vector. 
   El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.
   Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
   En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
   -Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
   La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.
   -Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.
   En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.
    
   *  Selección de celulas recombinanates
   
   
   Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.
   Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
   Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota. 
   
   
   
   
   
   
    BIBLIOGRAFIA
   
   
    
   http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html
   
   
   http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos3.htm#5