10.2
Técnicas de hibridación.
la hibridación de acidos nucleicos
La hibridación del ADN es el proceso más común para detectar
un gen particular o un segmento de un ácido nucleico. Existen muchas
variaciones del método básico, el que mas se utiliza es el uso de fragmentos de
ADN o ARN marcados radioactivamente conocidos como sondas. De hecho esta
metodología es la base de la amplificación controlada de ADN conocida como PCR por sus
siglas en inglés Polimerase Chain
Reaction o reacción en cadena de la polimerasa que se
utiliza para la clonación y secuenciación de ADN. Durante la hibridaciónse produce la unión de las moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de lacomplementariedad de bases. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración decloruro sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque existanalgunas bases no complementarias.
TECNICS DE HIBR IDACION
Hibridación in situ
con filtro (HISF).
La hibridación in situ es la hibridación de fragmentos
marcados de ADN de una hebra o de ARN con secuencias complementarias (sondas)
a ADN/ARN celular, que en condiciones apropiadas forman híbridos
estables. En general, la hibridación puede hacerse sobre soportes
sólidos (filtros de nylon o nitrocelulosa), en solución
(in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ).
Se pueden utilizar sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como
se necesita protección y manipulación especiales , no son
de elección para su uso rutinario. Las técnicas no-isotópicas
o colorimétricas son más rápidas y permiten una localización
más precisa de la reacción. Las sondas marcadas sin elementos
radioactivos son más estables y más baratas. La sensibilidad
es igual o levemente inferior a la de los métodos isotópicos.
Se han utilizado sondas marcadas con biotina y digoxigenina.
Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la
muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma
por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la
enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos
de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el
ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en
gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN
se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación.
El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La
especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la
purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que
permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el
ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad
técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados,
puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce
muy notablemente.
El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con
con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI
requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior
al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos
genotipos en un espécimen.
El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su
desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa
en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la
misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradigrafía,
si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron
frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especímenes mientras
que el SB no admite mas de 15. Uno de los problemas mas importantes del DB es
el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecíficas. Este
problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los híbridos
ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecíficas
pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa (2).
La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica
utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región
complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y
fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está
marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección.La
HS es un método con una especificidad estimada en 1-5 X 105 moléculas
de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS
tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser
analizado por muestra, además, para obtener buenos resultados se necesita un
volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (3).
La hibridación
Northern se
utiliza para la detcción de RNA de HPVs.
El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que
contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.
En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido
nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una
biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente
describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.
Detalle de la tecnica de Southern
La técnica de Southern blot permite el análisis de ADN
genómico o fragmentos definidos de ADN después de digestión
con endonucleasas de restricción. La técnica de Northern
blot permite estudiar ARN en forma análoga. El Western blot es
una técnica inmunológica derivada , que se utiliza para
analizar antígenos proteicos. Las proteínas se separan mediante
electroforesis y se transfieren a una membrana sólida o membrana
o filtro. La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente
con sondas marcadas radioactivamente o con enzimas.
La técnica de Southern Blotting permite
identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme
colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El
siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena
doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph
básico.
La molécula de cadena única es transferida desde
el gel a una membrana de nilón o a papel de nitrocelulosa, ayudado por
capilaridad.
La identificación de uno o más fragmentos de
interés se logra con una sonda específica marcada con radioactividad o
colorimetría. La sonda marcada se incuba con el filtro de nilón o nitrocelulosa
en una solución que favorece la formación de ADN de doble cadena. Después de
lavar el filtro, para retirar la sonda que no se unió a su cadena
complementaria, el filtro se expone a un film de Rx durante 24 a 48 horas, para
observar la posición de uno o más fragmentos a los que la sonda ha hibridizado,
lo que se observa como una banda negra después del revelado.
BIBLIOGRAFIA
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